등온고리증폭법을 이용한 열대거세미나방 종진단법 개발

영농기술정보

제목	등온고리증폭법을 이용한 열대거세미나방 종진단법 개발
활용분야	작물보호
검색어	열대거세미나방, 종 진단, 분자 진단, 등온고리증폭법, 방제
활용내용 요약	□ 배경 ○ 열대거세미나방은 2019년 국내발생이 최초 확인, 2020년 5월 현재 재발생 확인 ○ 옥수수 등 다양한 식량작물을 가해하나 특히 유충 단계에서 종진단이 어려움 ○ 빠르고 정확한 종진단은 효과적인 방제로 직결되기 때문에 현장에서 활용이 가능한 분자 종진단법 개발의 요구가 꾸준히 있었음   □ 개발된 영농기술정보 ○ 2019국내에서 발생한 열대거세미나방 3지역 집단(제주, 무안, 밀양)의 미토콘드리아 전장 유전체를 해독 후 종 특이적 염기서열 기반 종진단 마커 개발 ○ 종 특이적 마커를 진단 할 수 있는 등온고리증폭법 개발 - 개발된 분자 진단법은 1시간 30분 내 결과확인 가능(개체별 판별 가능) - 별도의 DNA 추출 없이 유충 및 성충 단계에서 대량 진단 가능 - 진단 농도 한계는 10pg으로 극히 적은 양으로도 진단이 가능   □ 파급효과 ○ 신속 정확한 비래 해충 발생 진단으로 인한 농가 경영비 절감 ○ 열대거세미나방 확진시, 방제 효과가 우수한 살충제를 사용하여 효과적 방제 가능 ○ 침입해충에 대한 진단을 통한 농가 민원 선제적 대응
활용구분	영농기술					영농정보
	신기술 보급	○	현장실증 현장접목	○		농업기술 길잡이		교육․현장 연시		국가농업기술포털
연구개발자	농촌진흥청 국립식량과학원 고령지농업연구소 김주일 (전화 : 033-330-1930, e-mail :forweek@korea.kr)

침입 해충인 열대거세미나방의 분자 종 진단법 및 방제요령

 

□ 배경

○ 열대거세미나방은 아메리카 대륙의 열대·아열대 지역이 원산지이며, 아프리카(‘16)를 시작으로 인도·동남아시아(’18), 중국·일본(‘19) 등 최근 세계적으로 급속히 확산되고 있는 장거리 이동성 해충임

○ 이 해충은 옥수수, 수수, 사탕수수 등 벼과 식물을 비롯한 약 80여개의 기주식물이 알려져 있으며, 유충이 기주식물의 잎과 줄기, 이삭을 가해하여 큰 피해를 줌

○ 우리나라에서는 2019년 6월 제주도에서 처음으로 발견된 이후 전남북, 경남북 등 전국에서 발생이 추가 확인되어 중요한 비래해충으로서 농작물 피해가 우려되고 있음

* 2019년도 발생시군 및 피해면적 : 8개도 31개시군 50.5ha (대부분 옥수수)

○ 앞으로 상습적이며 지속적인 비래해충이 될 것으로 예상되나 농가 포장에서 발생 할 경우 유사종과 형태적으로 확실히 구별이 되지 않는 경우가 있어 정확하고 신속한 분자 종 동정법 개발이 시급

 

□ 영농기술정보 개요

○ 2019년 국내에서 발생한 3지역집단의 열대거세미나방의 미토콘드리아 전장 유전체를 해독 후 종 특이적 염기서열 기반 종진단 마커 개발

○ 종 특이적 마커를 진단 할 수 있는 등온고리증폭법 개발

- 개발된 분자 진단법은 1시간 30분 내 결과확인 가능(개체별 판별 가능)

- 별도의 DNA 추출 없이 유충 및 성충 단계에서 대량 진단 가능

- 진단 농도 한계는 10pg으로 극히 적은 양으로도 진단이 가능

■ 진단 과정 요약 1. 시료 준비: 유충 혹은 성충 조직 일부를 30ul 멸균수가 담긴 PCR 튜브에 놓은 후 95℃ 5분 반응   2. LAMP: 시료 3ul 와 LAMP 시약 (WarmStart® LAMP Kit 등) 과 프라이머(FAW_F3, B3, FIP, BIP)를 넣고 61℃ 90분 반응   3. 진단 확인: 열대거세미나방(노란색), 기타(분홍색, kit에 포함된 기본 프로토콜 참조)

□ 연구결과

○ 제주(GenBank MN599981), 무안(MN599982), 밀양(MN599983) 집단의 미토콘드리아 전장 유전체 약 15,368bp 분석 결과 근연종인 담배거세미나방과는 97% 이상 높은 상동성을 보였으며 파바마방과도 94% 이상의 상동성을 보였음

○ tRNA 유전자 부분에서 종특이적 염기서열을 확인, 등온고리증폭법 진단 마커로 활용

○ 등온고리증폭법 적용 가능온도는 59~61℃이나 최적온도는 61℃

○ 기본 4개의 프라이머 이외에 loop 프라이머를 제작, 활용한 결과 효율성 증대

○ 별도의 DNA 추출과정 없이 유충 혹은 성충 조직 일부를 95℃에서 5분간 멸균수와 반응 후 바로 진단에 활용이 가능, 일반 PCR도 활용이 가능

○ 진단 한계 농도는 10pg으로 극히 적은양의 DNA만 있어도 지단이 가능

○ 페로몬 트랩 채집 개체(죽은 개체)에서도 진단이 가능하고 별도의 DNA 추출 단계가 없어 과정이 간단하여 시군 센터 등에서도 손쉽게 활용 가능

미토콘드리아 전장 유전체 분석	근연종간의 유연관계 분석, 종특이적 마커 개발

마커 기반 프라이머 제작	일반 PCR을 이용한 종진단 확인

등온고리증폭법 진단법 개발	진단 한계 농도 확인	진단법 현장 활용

○ LAMP, PCR에 사용 가능한 프라이머

	Primers	Sequence (5'->3')
for LAMP	FAW_F3	GGGCTCCTTATTTAAAATAAATAAATAATA
	FAW_B3	GTTGTTAGAGGAAGATTTTTAAGTTG
	FAW_FIP	TACCTAATTTATCTACTTATGGTTTAAGATATCAATATTTTTTAATAAAGATTGACC
	FAW_BIP	ATTCTCATATTTCTAATAAAATATCCTAATATACCTCCTTATATGATTTATTTACCTT
	FAW_LF	TATTTTCTTAATTTAGGTCAATC
	FAW_LB	CCTATTAATCTTACATAAATAACTAT
for PCR	FAW_UR	AGGATGAAGAGAAATTTATAGAGGAT
	BAW_DF	TTACTTAATCACTTCACTTACTTTCC
	LCO1490	GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG
	HCO2198	TAAACTTCAGGCTGACCAAAAAATCA

 

 

□ 파급효과

○ 신속 정확한 비래 해충 발생 진단으로 인한 농가 경영비 절감

○ 열대거세미나방 확진시, 방제 효과가 우수한 살충제를 사용하여 효과적 방제 가능

○ 침입해충에 대한 진단을 통한 농가 민원 선제적 대응

○ 경제성 분석 (단위: 원/10a) (1회 오동정으로 인한 약제 1회 살포기준, 옥수수)

손실적 요소(A)	이익적 요소(B)
o 약제 살포비용(10a 기준) - 옥수수 등록약제 = 15,000원 (250ml/1병) - 인건비(1인) : 120,000원 (15,000원/시간, 8시간) - 기타 : 45,000원 (유류비 34,000원 + 감가상각비 11,000원) 계(A) : 180,000원 (15,000+120,000+45,000)	o 평균수확량 5,000개/10a (a) o 옥수수 이삭 단가 300원/개 (b) o 방제시 평균 피해율 10% (c) o 무처리 평균 피해율 41% (d) o 방제시 소득 [a - (a×c/100)]×b = 1,350천원 (가) o 무방제시 소득 [a - (a×d/100)]×b = 900천원 (나) o 이익(B) = 450,000원 (가–나)
o 추정수익액(B-A) = 450,000 – 180,000 = 270,000원

 

 

 

○ 분자 종동정법 개선에 따른 경제성 분석(1회 진단)

손실적 요소(A)	이익적 요소(B)
o 분석 소용 시간: 1시간 30분   o 등온고리증폭법 비용(1회 기준) - 시약 비용 = 2,200원 (25ul/1 reation) * WarmStart® Colorimetric LAMP 2X Master Mix 기준 1,100,000원 (500 reaction)   o 기타 멸균수 및 기기 사용료 불포함 계(A) : 2,200원	o 총 분석 소요 시간: 약 2일   o 일반 PCR 비용(1회 기준) - 시약 비용 = 1,275원 (20ul/1 reation) * KOD FX (KFX-201, 200U) 기준 255,000원 (200 reaction) o PCR 산물 정제 비용(1회 기준) - 시약 비용 = 2,880원 (1 reaction) * QIAquick PCR Purification Kit 기준 144,000원 (50 reaction) o 염기서열 분석 비용(1회 기준) - 분석 비용 = 8,813원 (1 reaction) * [20식량원 분석단가-9]MG DNA Sequencing (양방향 기준)   o 기타 멸균수 및 기기 사용료 불포함 계(B) : 12,968원
o 추정수익액(B-A) = 12,968 – 2,200 = 10,768원

- 기존 염기서열 분석 방식으로 인한 분자 종동정 대비 시간 비용 대폭 감소

 

□ 관련 참고 영농기술정보 목록

○ 영농활용기술 : 3건

연번	활용분야	영농활용기술명	개발연도	개발자
1	작물보호	열대거세미나방 방제약제의 약효 검정	2019	정인홍
2	작물보호	열대거세미나방의 옥수수 피해증상 및 발생예찰용 페로몬 추천	2019	김현주
3	작물보호	성페로몬트랩을 이용한 열대거세미나방 예찰 방법 교육 자료	2019	서보윤

○ 참고 영농기술정보: 1건

연번	활용분야	영농활용기술명	개발연도	개발자
1	작물보호	열대거세미나방의 최초 발생과 피해	2019	이관석